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 tp de microbiologie

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عدد المساهمات : 79
تاريخ التسجيل : 03/02/2011

مُساهمةموضوع: tp de microbiologie   الثلاثاء فبراير 22, 2011 9:43 pm

1.
Etude cytologique

La fixation des cellules étalées sur lames est fait :
- par séchage à l'air (comme en technique hématologique),
- par vaporisation d'un spray,
- par immersion dans un fixateur liquide (alcool + éther).

La fixation immédiate, au moment du prélèvement, est indispensable pour préserver les cellules dont seule une bonne conservation permet l'étude cytologique ultérieure.
La coloration des lames se fait :
- par la technique de May-Grunwald-Giemsa (MGG) utilisée en hématologie
- par diverses associations de colorants nucléaires et cytoplasmiques (Papanicolaou, Harris-Shorr)
- éventuellement par des colorations particulières dérivées des techniques histochimiques utilisées en histopathologie, comme par exemple, le PAS, coloration de Gram, de Ziehl, argentation de Grocott,...(à la recherche d'agents pathogènes)ou par des techniques immunohistochimiques utilisant des anticorps marqués.

L’observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules
d’une espèce bactérienne. Elle comprend :
I. Examen à l’état frais
C’est l’examen microscopique de bactéries vivantes, en milieu liquide. Il permet d’apprécier
leur mobilité (ou immobilité) et leur morphologie.
 Préparation :
1. A partir d’une culture en milieu liquide :
Déposer sur une lame propre soit le contenu d’une « anse de platine » soit « une petite
goutte » à l’aide d’une pipette Pasteur. Recouvrir la goutte d’une lamelle.
2. A partir d’une culture sur milieu solide :
Déposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau) sur la lame. Prélever une trace de
culture à l’anse de platine et l’émulsionner dans le liquide.
Recouvrir d’une lamelle.











1. Flamber l’anse de
platine




2. Déposer une goutte de
la suspension bactérienne




















L’examen après coloration permet d’observer des bactéries tuées fixées sur une lame
et ayant subi l’action d’un ou plusieurs colorants. Les colorations, réalisées sur des frottis
sèches et fixes, sont classées en :
•Coloration simple (un seul colorant)
•Coloration différentielle type Gram
•Colorations spéciales des structures bactériennes (capsules, spors….).
Remarque :
La réalisation de frottis de bonne qualité est une condition préalable à toute coloration.
1. Réalisation des frottis :
Les frottis doivent être étalés en couche mince et régulière, puis séchés et fixés.
1. Etalement sur lame de verre :
1. Notez la référence de l’échantillon sur une lame parfaitement propres et
dégraissées, 2. Prélevez stérilement à l’aide d’une anse de platine une goutte de culture
bactérienne et étalez un film mince,
2. Séchage :
Le séchage est effectué à l’aire libre jusqu’à ce que le frottis présente un aspect mat.
3. Fixation du frottis sec :
Cette étape consiste à tuer les bactéries et les coller sur la lame, sans en altérer la
structure. La fixation s’effectue par la chaleur :
La lame, tenue par une pince (frottis situé sur le dessus) est passée 3ou 4 fois dans
la flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir avant d’entreprendre une coloration.
1. Identifier la lame 2. Déposer une goutte d’eau
3. Flamber l’anse 4. Prélever une partie
d’une colonie isolée
5. Mélanger les bactéries avec la goutte d’eau 6. Laisser sécher
l’étalement à
l’air
7. Fixé le frottis en passant délicatement et rapidement la lame 2-3 fois au dessus de la
flamme
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I. COLORATIONS SIMPLES : (Coloration au bleu de Méthylène)
La coloration au bleu de méthylène peut apporter des informations concernant la
morphologie des germes.
Mode opératoire :
Sur le frottis fixé et refroidi :
- Faire couler la solution de bleu de méthylène phéniqué jusqu'à ce que toute la lame
soit recouverte.
- Laisser agir 1 minute.
- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distillée, ou à l'eau du
robinet jusqu'à élimination des colorants en excès.
- Sécher à l'air ou sur une platine chauffante, ou encore sécher délicatement entre deux
feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
- Examiner au microscope, objectif à immersion.
Résultats
Les bactéries sont colorées en bleu sombre. Cette coloration est intéressante pour
l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement l'étude de la morphologie des
bactéries.
1. Réaliser un étalement sur lame

2. Coloration au bleu de méthylène




3. Elimination du bleu de méthylène
TP. N° 8 - COLORATION DIFFERENTIELLE DE GRAM
C’est la coloration de base en bactériologie qui permet de distinguer les bactéries en
Gram positif et en Gram négatif, cette distinction est fondamentale pour leur identification.
En effet, le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce
temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la
paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le
cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière
imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet.
Réactifs :
- Violet de gentiane phénique
- Lugol (iodo-iodure de potassium)
- Alcool à 95% (ou mélange alcool absolu+ 1/5ème d’acétone)
- Safranine (ou Fuchsine phéniquée de ziehl)
Mode opératoire :
1. Réaliser un frottis et le fixer à la flamme
2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact 1 minute
3. Jeter le colorant et finir de la chasser par la solution de Lugol ; laisser agir le Lugol
environ 1 min
4. Jeter le Lugol et faire couler de l’alcool sur la préparation ; rincer immédiatement à
l’eau
5. Recouvrir la préparation de Safranine, laisser agir environ 1 min. laver abondamment.
6. Sécher au dessus de la flamme d’un bec Bunsen.
Résultats :
A l’issue de cette coloration, on peut distinguer :
- Des bactéries colorées en violet foncé ; elles ont gardé le violet, ‘le gram’ elle sont
dites ‘Gram positif’ ;
- Des bactéries colorées en rose ou rouge pâle ; elles ont perdu le violet, ‘le Gram’
elles sont dites ‘gram négatif’.
22
1. Prélever une partie d’une colonie isolée

Anse bouclée







2. Réaliser un étalement sur lame




3. Fixer à la chaleur



4. Réaliser les étapes de coloration
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